Як провести фарбування за Грамом
Фарбування по Граму - це метод дослідження, що дозволяє встановити наявність бактерій, і диференціювати їх як грампозитивних, або грамнегативних. Метод заснований на біохімічні властивості клітинної стінки. Метод Грама майже завжди застосовують для мікробіологічної діагностики інфекційних захворювань.
Метод був запропонований в 1884 році датським лікарем Г.К.Грамом, який розробив і опублікував його в 1884 році, як спосіб диференціювати подібні за симптомами інфекції (Streptococcus pneumoniae (Пневмокок) і Klebsiella pneumoniae.
Кроки
1
Приготуйте зразок для дослідження. Наприклад, якщо ви підозрюєте пневмонію, вам буде потрібно зразок мокротиння. Якщо інфекцію сечовивідних шляхів - візьміть зразок сечі. Для дослідження кишкових інфекцій потрібен зразок калу. Для дослідження інфекцій мозку потрібно спинномозкова рідина (досліджується осад після центрифугування). Для шкірної інфекції проведіть біопсію шкіри. Інфекції середнього вуха досліджують по рідини із середнього вуха (після центрифугування рідина розділяється на три шари, вам потрібен середній). Будь тканина людини може бути використана для дослідження.
2
Помістіть одну-дві краплі зразка на предметне скло. Розподіліть мазок тонким шаром по склу, наприклад краєм іншого скла. Нехай зразок висохне.
3
Зафіксуйте мазок, для чого плавним рухом проведіть предметним склом 2-3 рази над верхньою частиною полум`я пальника, також можна нагріти зразок на електричному нагрівачі. Чи не перегрівайте скло. Мазок можна зафіксувати і метиловим спиртом. Додайте 1-2 краплі на висушений зразок, злийте надлишки спирту і висушіть. Другий спосіб краще, в силу того, що він менше пошкоджує досліджуваний зразок.
4
Нанесіть на зразок розчин кристалічного фіолетового. Зачекайте тридцять секунд. Кристалічний фіолетовий у водних розчинах виділяє іони хлору (Cl-). Грампозитивні бактерії міцно фарбуються розчином після обробки йодом. Грамнегативні бактерії утворюють з крісталлвіолетом і йодом легко руйнується під дією етанолу з`єднання.
5
Акуратно змийте фарбник водою. Занадто сильний напір може змити грампозитивні бактерії, будьте обережні.
6
Нанесіть йод як мінімум на три секунди. Йод фіксує забарвлення.
7
Акуратно змийте водою.
8
Знебарвлюється мазок, наливаючи на предметне скло етанол або ацетон, продовжуйте процедуру, поки що стікає рідина не стане чистою. Якщо ви вчасно не зупинитеся, знебарвлення може торкнутися і грампозитивні бактерії теж.- У грампозитивних бактерій клітинні стінки містять мало ліпідів, а у грамнегативних клітинні стінки навпаки багаті ліпідами. У процесі грамнегативнібактерії втрачають зовнішню мембрану, тому при знебарвленні барвник вимивається. Грампозитивні бактерії, навпаки утворюють міцне з`єднання з барвником.
9
Акуратно змийте знебарвлюючий розчин водою.
10
Нанесіть сафранін на тридцять секунд. Цей розчин забарвлює грамнегативнібактерії в рожевий або червоний колір. Фуксин краще виявляє анаеробні бактерії, його можна використовувати замість сафраніну.
11
Акуратно змийте надлишки сафраніну.
12
Висушіть зразок. Готово.
13
Вивчіть зразок під мікроскопом. Грампозитивні зберігають фіолетовий колір. Грамнегативні виглядають рожевими. Подальша класифікація полягає у визначенні форми бактерії. Часто це бувають коки (округлі) і бацили (паличкоподібні). Класифікація:- Грампозитивні коки - як правило це стафілококи (У вигляді виноградних грон) або стрептококи (Утворюють ланцюжки).
- Грампозитивні палички включають в себе бацили, клостридії, і Лістерію. Також можна виявити збудник дифтерії.
- Грамнегативні коки найчастіше представлені різними видами Neisseria.
- Грамнегативні палички поділяються на:
- Грамнегативні "коккобактеріі", наприклад Bordetella, Brucella, Haemophilus, Pasteurella.
- Інші грамнегативні палички (Не коккобактеріі), наприклад E. coli, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, Serratia, Proteus, Salmonella, Shigella, Pseudomonas, та багато інших.
Поради
- Використовуйте тільки чисті предметні скла.
- Чи не перегрівайте.
- Змивайте обережно.
- Мазок повинен бути тонким.
- Готуйте зразок правильно.
- При знебарвленні етиловий спирт діє повільніше, ніж ацетон.
- Дотримуйтесь заходів безпеки, і обов`язково вдягайте рукавички.
- Предметне скло можна вимити або використовувати тільки нові.
Попередження
- Йод небезпечний. Чи не вдихайте і не ковтайте йод, уникайте контакту зі шкірою. Використовуйте рукавички, працюйте у вентильованому приміщенні.
- Ацетон і спирт вогненебезпечні. Ацетон знежирює шкіру. Дотримуйтесь заходів безпеки.
Що вам знадобиться
- Зразок досліджуваної тканини
- Центрифуга
- Предметні скла
- Піпетка
- Пальник, нагрівач, або метанол
- Вода
- Крісталлвіолет
- Йод
- Етанол або ацетон
- Сафранін
